Tinción de Gram: usos, características y tipos

Cuando sufrimos una infección bacteriana es imprescindible saber a qué tipo de bacteria nos estamos enfrentando. Y es que en función de esto, nos tendrán que administrar unos antibióticos u otros. Pero, ¿cómo sabemos cuál es? ¿Mirando simplemente a través del microscopio? Ojalá fuera tan sencillo.

Al obtener una muestra de algún tejido, a priori, infectado y prepararla para visualizarla en el microscopio, si no realizamos algunos tratamientos previos, no veríamos absolutamente nada. En el día a día de la microbiología, las preparaciones tienen que teñirse.

Esto significa que encima de la muestra debemos aplicar un colorante que permita hacer visibles a las bacterias, que revele su forma y tamaño, que haga posible la identificación de estructuras internas y externas de estas células y, sobre todo, que se comporte (reaccione) de forma distinta dependiendo de la especie bacteriana en cuestión.

Y en este sentido, la tinción de Gram es, quizás, la más famosa y útil del mundo. Esta técnica es básica para la valoración inicial de muestras bacterianas, pues dependiendo de cómo actúe el colorante y el color que adopte al entrar en contacto con las bacterias, permitirá establecer dos grupos principales: gram positivas o gram negativas. Este es el primer paso en la identificación, pues cada uno de estos grupos es sensible a unos antibióticos determinados. En el artículo de hoy explicaremos en qué consiste la tinción de Gram, cómo se realiza y qué utilidades tiene.

¿Tan importantes son las tinciones?

No es que las tinciones sean importantes, es que son imprescindibles. En el ámbito de la clínica, los microscopios son las herramientas más útiles para identificar especies de patógenos. Son herramientas muy precisas que permiten amplificar unas 1.400 veces una muestra, pero incluso así no es suficiente para saber ante qué bacteria nos encontramos.

• Te recomendamos leer: “Los 18 tipos de microscopio (y sus características)”

Por muy potente que sea el microscopio y por muy experimentado que sea el científico, observando una muestra “a secas” no podrá identificar la especie bacteriana en cuestión. Entonces, ¿qué hacemos? ¿Analizar genéticamente la bacteria? Esto sería una total pérdida de tiempo.

La realidad de la práctica clínica en microbiología es que la herramienta por excelencia para identificar especies bacterianas son las tinciones, las cuales consisten en técnicas de diagnóstico en las que se aplica un colorante en la muestra para que este revele información importante sobre el grupo bacteriano ante el que nos encontramos.

En este campo, por colorante entendemos cualquier sustancia química que, en contacto con un tejido vivo, es capaz de dar color a las células. Y es que aunque los microorganismos pueden observarse directamente en el microscopio, si queremos identificar cuál es, tendremos que aplicar encima de ellos un colorante.

Y dependiendo del colorante utilizado, estaremos ante un tipo de tinción u otra. Si se usa un único colorante y la muestra se tiñe del mismo color, se tratará de una tinción simple. Si el color se obtiene gracias a una molécula fluorescente unida a un anticuerpo que se une de forma específica a una estructura celular en concreto que queremos visualizar, estaremos ante una tinción específica. Y, por último, si se usa más de un colorante y se visualizan células de distinto color, será una tinción diferencial. Y esta última es la que nos interesa, pues la tinción de Gram pertenece a este grupo.

Entonces, ¿qué es la tinción de Gram?

Desarrollada en el año 1884 por el científico danés Hans Christian Gram, esta técnica de diagnóstico sigue siendo utilizada universalmente en el día a día de prácticamente todos los laboratorios de análisis microbiológico del mundo. Es eficaz, sencilla de realizar, rápida y económica.

La tinción de Gram es un tipo de tinción diferencial en la que se utilizan dos colorantes y que permite separar las bacterias en dos grandes grupos: las gram positivas y las gram negativas. De hecho, esta diferenciación es la base de la bacteriología. Y es que dependiendo de qué tipo sea la bacteria, el tratamiento necesario para combatirla será uno u otro. No es necesario saber exactamente qué bacteria es. Mientras sepamos si es gram positiva o negativa, normalmente tenemos suficiente.

Por lo tanto, la tinción de Gram es una técnica de diagnóstico preliminar que consiste en el primer paso para identificar la etiología de una enfermedad, es decir, saber qué patógeno es el causante de la misma.

Entonces, ¿cuándo se realiza? Quizás no hayas oído hablar de ella, pero si alguna vez has enfermado y te han tomado muestras para saber qué bacteria te había infectado, seguro que han realizado este tipo de tinción con la muestra. Y es que la tinción de Gram se utiliza en todas las situaciones de hospitales, clínicas o centros de investigación en las que se tenga que hacer una primera aproximación a la naturaleza de una infección bacteriana.

Infecciones de orina, neumonías, meningitis, sepsis, enfermedades intestinales, enfermedades de transmisión sexual, infecciones cardíacas, úlceras cutáneas infectadas… La tinción de Gram puede realizarse sobre cualquier muestra de tejido vivo en el que pueda haber bacterias.

Después de realizarla, es posible que los científicos y médicos ya tengan todo lo que necesitan para enfocar correctamente el tratamiento. También hay veces en las que deben realizarse pruebas de diagnóstico complementarias, pero igualmente la tinción de Gram sigue siendo la base.

Pero, ¿por qué unas bacterias se tiñen de una forma concreta y otras de una forma distinta? Más adelante analizaremos qué determina que una bacteria sea gram positiva o gram negativa, pero primero veamos cómo se realiza esta técnica.

¿Cómo se realiza la tinción de Gram?

La primera parte es recoger la muestra, la cual debe ser líquida o, al menos, viscosa, por lo que en caso de que el tejido sea sólido, deberá pasar por algún procesado previo para diluirlo en solución líquida. Sea como sea, se debe extender la muestra en un portaobjetos de cristal. En este punto, debemos dejar que la muestra se seque en el propio aire. Como será muy fina, tardará poco tiempo en hacerlo.

Una vez seca, es decir, cuando ya no quede agua, aplicamos metanol al portaobjetos, directamente encima de la muestra. Este compuesto químico es un alcohol, por lo que si las bacterias estaban vivas, morirán al instante. Esto no es ningún problema, pues pueden visualizarse perfectamente estando muertas. Este paso es imprescindible ya que así quedan pegadas a la superficie del portaobjetos y no las perderemos en los siguientes pasos.

Ahora es el momento de añadir el primer colorante (recordemos que al ser una tinción diferencial, se utilizan dos), que es el violeta de genciana, también conocido como cristal violeta. Este primer colorante teñirá todas las bacterias de color púrpura, después de dejar que actúe durante unos minutos. Se añade también un compuesto conocido como lugol, que sirve para impedir la salida del colorante de las células en las que ha entrado.

Pasado este tiempo, se lava la muestra para retirar el exceso de colorante y se añade una mezcla de alcohol y acetona. Este es el punto clave, pues esta sustancia química desteñirá aquellas bacterias que no han absorbido el primer colorante. Al poco tiempo, para evitar que las destiña todas, debe retirarse el alcohol-acetona con agua. En este momento ya podríamos visualizar las gram positivas (si es que las hay).

Pero faltan las gram negativas. Y aquí entra en juego el segundo colorante: la safranina o fucsina. Con este paso conseguimos que las bacterias que han perdido el primer colorante (de color púrpura) se tiñan de color rosa o rojo. Ahora ya tenemos las gram negativas (si es que las hay).

Ahora el científico ya puede llevar la muestra al laboratorio y observará células de color púrpura (o de un azul oscuro), que son las que han atrapado el primer colorante, y que representan las gram positivas; y células de color rojizo, que son las que han perdido el primer colorante y atrapado el segundo, y que representan las gram positivas.

Lo más habitual es que en la muestra solo haya un tipo, es decir, que todas sean o bien gram positivas o bien gram negativas. De este modo, el microbiólogo ya podrá tener una primera aproximación de qué tipo de bacteria ha causado la infección.

Gram positivas y gram negativas: ¿quién es quién?

Llevamos todo el artículo hablando de las bacterias gram positivas y las gram negativas, pero, ¿por qué se tiñen de colores distintos? ¿Por qué es tan importante esta clasificación? ¿En qué se diferencian? ¿Por qué cada una es sensible a unos antibióticos determinados? Ahora responderemos a todo esto.

Pero para entender por qué cada una se tiñe de un color distinto, debemos entender la naturaleza de su pared y membrana celular. Ahí es donde está la clave de todo. Porque la cobertura de las bacterias, básicamente, puede adoptar dos conformaciones. Y en función de cómo sea, reaccionará de una forma concreta a los colorantes.

Sin entrar demasiado en estructura y anatomía microbiana, lo importante es tener en cuenta que el modo cómo se tiñen las bacterias dependerá de las propiedades de su pared. Las bacterias gram positivas tienen una sola membrana celular y, por encima, una gruesa pared compuesta por peptidoglicano.

Las gram negativas, en cambio, tienen una membrana celular interna, por encima de esta una muy fina pared de peptidoglicano (nada que ver con lo gruesa que es la pared de las gram positivas) y, por encima de esta, una segunda membrana celular, que se conoce como membrana externa.

Toda la tinción de gram se basa en un único y fundamental principio: el primer colorante (el violeta de genciana o cristal violeta) tiene mucha afinidad por el peptidoglicano de la pared bacteriana. Ahora, pues, parece evidente lo que sucede.

Las gram positivas, como tienen mucho más peptidoglicano en su pared, retienen muy fácilmente este primer colorante. Las gram negativas (a las que, por cierto, hemos destruido la membrana externa al aplicar la mezcla de alcohol y acetona), en cambio, al tener muy poco peptidoglicano, no lo pueden retener. De ahí que, cuando lavamos la muestra, el primer colorante quede retenido en las gram positivas pero las negativas lo pierdan y, por lo tanto, se destiñan. En este momento, solo las positivas están teñidas con este color púrpura o azul oscuro.

Por último, se coloca el segundo colorante (la safranina), el cual ya no tiene afinidad por el peptidoglicano y, por lo tanto, puede unirse sin problema a las células que quedan sin teñir, que son las gram negativas. Estas bacterias se observarán de un color entre rojo y rosa.

Y como los antibióticos funcionan o no dependiendo también de cómo sea la pared, al saber si es positiva o negativa, sabremos qué antibióticos pueden funcionar y cuáles no. Esta es la gran utilidad de la técnica. Las gram positivas son sensibles a unos antibióticos y resistentes a otros. Y las gram negativas, igual.

• Te recomendamos leer: “Los 10 antibióticos más utilizados en medicina”

Las bacterias gram negativas cuentan con especies como “Neisseria meningitidis” (causante de meningitis), “Escherichia coli” (causante de gastroenteritis) o “Salmonella enterica” (causante de gastroenteritis).

De las gram positivas tenemos representantes como “Bacillus anthracis” (responsable del ántrax), “Clostridium botulinum” (causante del botulismo), “Staphylococcus aureus” (causante de infecciones en la piel o gastroenteritis) o “Streptococcus faecalis” (responsable de infecciones de orina).

En resumen, la tinción de Gram, pese a sus evidentes limitaciones, como por ejemplo la de no poder visualizar bacterias que no tienen pared celular (hay pocas, pero existen), ni bacterias con una composición química muy distinta a las demás ni, evidentemente, virus; es una técnica imprescindible en la práctica clínica para realizar una primera aproximación a qué patógeno puede ser el causante de una enfermedad.

Referencias bibliográficas

• López Jácome, L.E., Hernández Durán, M., Colín Castro, C.A. et al (2014) “Las tinciones básicas en el laboratorio de microbiología”. Investigación en Discapacidad.
• Jiménez Tobón, G.A., Vélez Hoyos, A. (2012) “Tinción de Gram de tejido: alcances y limitaciones”. Medicina & Laboratorio.
• Sandle, T. (2004) “Gram’s Stain: History and Explanation of the Fundamental Technique of Determinative Bacteriology”. IST Science and Technology Journal.
• Smith, A.C., Hussey, M.A. (2005) “Gram Stain Protocols”. American Society for Microbiology.